点评 | 鲁伯埙（复旦大学）、陈生第（上海交通大学）、邓汉湘（美国西北大学）、唐北沙（中南大学）
帕金森病 (Parkinson’s Disease, PD) 作为仅次于老年痴呆的第二大神经退行性疾病，在全球65岁以上人群中的发病率高达1-2%。其中PINK1基因突变可因功能缺失而引发青少年型帕金森疾病。长期以来，帕金森疾病被认为与细胞内供应能量的细胞器（线粒体）损伤有关而PINK1作为一种线粒体膜蛋白维护正常线粒体从而保护神经细胞。此经典理论主要是根据体外培养细胞实验中受损的线粒体可招募全长的PINK1蛋白而激活Parkin及泛素酶形成复合物结合受损线粒体,使其能被溶酶体及时清除 (图1)。此过程又被定义为线粒体自噬来维持线粒体稳态及正常功能和在不同病理情况下保护神经细胞。因此，长期以来，PINK1的表达与功能被认为与线粒体自噬密切相关。
2021年11月20日，暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院李晓江团队在Protein & Cell杂志上在线发表了研究长文（Research Article）PINK1 kinase dysfunction triggers neurodegeneration in the primate brain without impacting mitochondrial homeostasis（灵长类大脑中PINK1激酶的功能异常可造成神经变性而不影响线粒体稳态）。该项研究利用基因编辑猴模型与死亡人脑组织深入研究帕金森病致病基因PINK1的表达与功能，颠覆了长期以来建立在体外与小动物实验基础上的经典理论，为治疗帕金森疾病提供了新的思路及依据。动物模型是疾病机理与临床转化研究的重要工具。然而，所有报道的Pink1敲除小鼠模型均未出现类似病人大脑中明显神经退变的病理特征及线粒体损伤。传统学说认为正常生理情况下，PINK1表达水平极低，只有在特定线粒体应激情况下，内源性PINK1表达水平才增加并主要定位于线粒体外膜。暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院李晓江团队曾与中国医学科学院医学实验动物研究所的秦川教授及刘云波教授在2019年使用胚胎期CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了世界首例PINK1突变猴模型，发现PINK1突变可造成猴大脑出现严重的神经细胞变性死亡（Yang et al., Cell Res. 29:334-336, 2019），这与Pink1基因敲除小鼠模型到老年时期仍无明显神经细胞死亡的特征形成了鲜明对比。为何同样的基因在不同种属中敲除后会产生如此巨大的区别？经过深入研究，李晓江团队发现PINK1蛋白在灵长类大脑中表达丰富，而在小鼠体内难于检测到（图2）。图2.PINK1蛋白在小鼠、猴以及人体内的表达情况进一步研究发现，PINK1蛋白在灵长类大脑中并未富集在线粒体，而是作为激酶主要存在于胞浆中。因此，灵长类神经细胞的存活并不依赖于经典学说中所描述的PINK1对线粒体的调控作用，而是PINK1作为激酶通过磷酸化神经细胞功能相关蛋白来维持神经细胞的生存。此主要功能与大量体外培养细胞实验中通过线粒体应激而观察到的PINK1介导的线粒体自噬截然不同 (图3)。图3. 灵长类脑组织中的PINK1主要作为激酶磷酸化蛋白而维持神经细胞生存，而体外培养细胞在线粒体应激后PINK1主要发挥线粒体自噬功能。该发现颠覆了长期以来建立在大量体外与小动物实验基础上的传统理论，揭示了PINK1在灵长类脑组织中的主要功能是磷酸化关键神经蛋白,而并非是经典理论中的线粒体自自噬功能, 为治疗帕金森疾病提供了新的思路及依据。美国科学院院士袁均瑛教授在同期杂志中撰文评论该研究挑战了PINK1维持线粒体功能的学说并提供了充分证据说明需要探究PINK1在帕金森病中的非线粒体功能。结合近年来李晓江团队发现猪（Yan et al., Cell, 173(4):989-1002, 2018）及猴模型 (Yang et al., Cell Res. 29:334-336, 2019; Yin et al., Acta Neuropathol, 137(6):919-937, 2019) 能更好地模拟神经退行性疾病的典型病理变化，该研究进－步证实了利用大动物模型能更准确揭示疾病机理及寻找到有效治疗方法。论文的第一作者及共同通讯作者为暨南大学杨伟莉研究员。暨南大学郭祥玉副研究员,涂著池研究员及李世华教授等也参与了本项目的研究。华东师范大学的廖鲁剑教授团队为分析蛋白质磷酸化做出了重要贡献。李晓江教授为共同通讯作者。https://doi.org/10.1007/s13238-021-00888-xhttps://link.springer.com/article/10.1007/s13238-021-00889-w鲁伯埙：（复旦大学生命科学院教授，神经退行性疾病研究专家）：好的研究工作往往是解决了一个重要的科学问题，而划时代的研究工作则可能改变一个领域甚至多个领域的科学家的观念，开辟新的研究领域。李晓江教授团队最近发表于Protein & Cell的这篇研究论文无疑具备成为划时代的研究工作的潜力。目前关于帕金森病的论文大约12万篇，关于线粒体自噬大约六千篇，关于PINK1的文献大约3000篇，关于小鼠模型更是高达200万篇，而该论文可能对以上领域科学家的观念都产生影响。说起PINK1和帕金森病，科学家首先想到的就是其在线粒体上参与线粒体自噬的功能，从而参与帕金森病的发生发展；该论文则揭示其主要在细胞质通过磷酸化各种蛋白发挥作用，彻底颠覆了上述观点，从而可能对帕金森病、线粒体自噬、以及PINK1功能这三个研究领域产生深远影响。而重要的是，这样的发现是在灵长类模型中做出的，而小鼠模型中基本无法进行这样的研究。自上世纪九十年代初以来，小鼠模型成为了生物学研究最重要的动物模型，也的确有很多里程碑式的发现源自小鼠模型的实验。近年来随着技术进步，大动物模型包括灵长类模型开始兴起，并被认为可能可以更好的模拟人类疾病和生理。然而在分子层面，小鼠模型一般被认为具有足够的保守性，足以用于研究生理过程或重要疾病最核心的分子机制。然而对PINK1突变猴模型的研究则揭示，灵长类PINK1突变的影响不仅在组织表型层面与小鼠Pink1截然不同（Yang et al., Cell Res. 29:334-336, 2019），甚至在分子机制及细胞内定位方面都可能与小鼠Pink1有着根本不同。这值得每个使用小鼠模型的科学家思考。当然，要成为真正划时代的研究还需要更多的积累和时间的检验。本文开创了一个新的领域，研究PINK1在细胞质中磷酸化关键神经蛋白的功能、机制与病理意义。这里有很多有待解决的科学问题，例如哪些磷酸化底物是最重要的？如何被PINK1调控？其病理意义是什么？此外，灵长类PINK1与小鼠Pink1究竟为何有这样根本的区别？其结构有何不同？或者其调控、翻译后修饰、互作蛋白等有何不同造成了这样的差异？解决上述问题可能可以指导我们真正弄清何时可以使用小鼠模型，何时需要使用灵长类或者其他大动物模型，从而更好的构建和使用动物模型。期待李晓江教授团队在相关领域有更多突破性的进展。陈生第（上海交通大学医学院附属瑞金医院教授、帕金森疾病研究专家）：大量体外研究发现PINK1蛋白可与帕金森病（PD）的另一致病基因Parkin参与线粒体自噬及线粒体功能调控，然而这种传统理论尚缺乏体内实验的证据。Pink1敲除的小鼠模型并不出现PD病人大脑中神经细胞死亡的病理特征，且小鼠脑内很难检测到内源性Pink1。2018年又有研究报道Pink1敲除小鼠在生理状态下并不影响线粒体自噬 （McWilliams et al., Cell Metab. 2018 27(2):439-449），由此引出一个关键问题：PINK1的主要功能是什么？是否主要作用于线粒体自噬及维持线粒体稳态？而要解决这个关键疑问，急需能够模拟PINK1突变病人神经病理特征的动物模型。李晓江团队过去十多年来一直聚焦利用大动物模型研究神经退行性疾病，曾在2019年通过胚胎期CRISPR/Cas9打靶法建立了PINK1突变猴模型（Yang et.al., Cell Res. 29(4):334-336, 2019），发现PINK1缺失可造成猴大脑出现严重的神经变性死亡。该团队发表在Protein & Cell杂志的文章是他们进一步研究PINK1在灵长类大脑中功能的重要成果。该研究首先发现PINK1以激酶方式在灵长类大脑中表达丰富，而在小鼠模型中较难检测到其表达。同时，猴脑中内源性PINK1激酶主要表达在细胞浆中，而与线粒体无明显共定位，且PINK1缺失造成的神经细胞死亡并未伴随明显的线粒体功能失调。更重要的是，PINK1缺失造成大量神经细胞蛋白磷酸化减少而导致神经细胞死亡。应该说这项研究成果挑战了大量体外实验中所发现的PINK1调控线粒体自噬的传统理论。小动物模型在生命科学及疾病研究中发挥了非常重要的作用，阐明了一系列重大生物学规律及分子调控的共有通路。近年来CRISPR/Cas9等技术的不断发展为我们利用在进化上与人类更为接近的物种研究疾病的发生发展及生物学规律提供了很好的工具。利用猴建立疾病模型不容易，时间周期太长，价格又昂贵，工作量巨大，但李晓江团队这项研究也让我们思考：有些致病基因是在人和小动物模型中的功能并非完全一样。显然，同一致病基因PINK1在小鼠和猴模型中造成如此显著的病理差别的研究将为我们研究其他重要致病基因提供一个很好的借鉴：那就是小鼠中不能模拟病人病理特征的致病基因可能需要考虑物种差异性，需要利用大动物模型进行深入研究。邓汉湘（Han-Xiang Deng）（美国西北大学医学院教授、帕金森疾病研究专家）:PINK1和Parkin的基因突变均可导致帕金森疾病,而这二种蛋白被认是通过线粒体自噬来维护线粒体稳态从而保护神经细胞。但这个经典理论主要是根据体外培养细胞受损线粒体实验后的结果。已报道的PINK1敲除小鼠模型并无明显神经细胞死亡的特征，也不影响影响线粒体自噬的基本功能 （McWilliams et al., Cell Metab. 2018 27(2):439-449）。所以，PINK1的体内功能仍不明确。发表在Protein & Cell 的研究用非人灵长类动物模型首次揭示了PINK1非线粒体的功能。此研究成果至少有二个意义: 一是非人灵长类动物模型能够揭示小动模型无法模拟的重要病理变化；二是同样一个致病基因在不同种属中可有不同功能及造成不同病理变化。因此，该研究成果对研究其它重要疾病亦有重要借鉴意义。 由于Parkin缺失小鼠模型也无明显神经细胞死亡, 接下来一个重要问题是Parkin缺失是否在非人灵长类动物中亦可造成与病人脑内相似的病理变化。唐北沙（中南大学湘雅医院教授、帕金森疾病研究专家）：帕金森病 (Parkinson's disease, PD) 是一种常见的神经变性疾病，其病因和发病机制仍不明确，遗传和环境等因素与其发病密切有关。目前已报道了20余个家族性PD致病基因，如Parkin、PINK1、DJ-1等。PINK1蛋白作为线粒体激酶，可参与线粒体自噬及线粒体质量调控，同时还可通过磷酸化多种蛋白调控细胞功能。PINK1基因是常见的常染色体隐性遗传PD致病基因之一，其突变可导致PINK1蛋白功能缺失参与PD的发生，突变形式包括错义突变、无义突变、移码突变和外显子缺失等，PINK1基因突变的PD患者发病年龄多为20-40岁，部分患者发病年龄早于20岁，神经病理学检查证实PINK1基因突变的PD患者存在中脑黑质多巴胺能神经元的丢失，但路易小体的形成非常罕见。自发现PINK1基因突变与PD发病相关以来，研究者一直在探究其具体的致病机制。李晓江团队曾在2019年利用CRISPR/Cas9技术建立了PINK1基因缺失突变的非人灵长类猴模型（Yang et.al., Cell Res. 2019），发现PINK1在胚胎期缺失即可导致猴脑出现严重的神经元变性死亡，而Pink1敲除的小鼠即使在老年期仍未出现明显的神经元变性死亡。近期，李晓江实验室在Protein & Cell发表的研究 (Yang et.al, Protein & Cell, 2021)，首次在非人灵长类猴模型中证明PINK1缺失并不影响线粒体自噬，但可通过影响蛋白质磷酸化而造成神经元死亡，这一发现与PINK1调控线粒体自噬的传统理论形成鲜明对比。目前已报道的PINK1敲除猪模型（Zhou et al., Cell Mol Life Sci. 2015; Wang et al., Sci Rep, 2016）也并未出现明显的神经元病变，因此本研究成果意味着PINK1蛋白可能是灵长类动物大脑中的特异功能蛋白，对揭示PINK1蛋白的功能具有重大意义。此外，该研究中所利用的转基因猴模型为PINK1基因大片段缺失突变，该缺失突变所导致的神经元死亡表明了PINK1蛋白对神经元生存起着至关重要的作用，当然，考虑到PINK1基因点突变在PD患者中更为常见，那么在后续的工作，如能建立PINK1基因点突变的非人灵长类猴模型，来探讨PINK1基因点突变是否可导致神经元死亡，并进一步研究PINK1基因点突变导致神经元死亡的分子机制，这将为临床的诊断及精准治疗提供更多理论依据。转载须知
【非原创文章】本文著作权归文章作者所有，欢迎个人转发分享，未经允许禁止转载，作者拥有所有法定权利，违者必究。